PCR反応における干渉因子

PCR 反応中に、いくつかの干渉因子に遭遇することがよくあります。
PCR は感度が非常に高いため、汚染は PCR 結果に影響を与える最も重要な要因の 1 つであると考えられており、偽陽性結果が生じる可能性があります。
同様に重要なのは、偽陰性の結果につながるさまざまな原因です。 PCR 混合物の 1 つ以上の必須部分または増幅反応自体が阻害または妨害されると、診断アッセイが妨げられる可能性があります。これにより、効率が低下し、さらには偽陰性の結果が生じる可能性があります。
阻害に加えて、サンプル調製前の輸送および/または保管条件により、標的核酸の完全性の損失が発生する可能性があります。特に、高温または不適切な保管は、細胞や核酸の損傷につながる可能性があります。細胞および組織の固定およびパラフィン包埋は、DNA 断片化および永続的な問題のよく知られた原因です (図 1 および 2 を参照)。このような場合、最適な分離と精製を行っても役に立ちません。

図1 | DNA の完全性に対する固定化の影響
アガロースゲル電気泳動により、剖検のパラフィン切片から単離された DNA の品質が大幅に異なることが示されました。固定方法に応じて、異なる平均断片長の DNA が抽出物中に存在しました。 DNA は、天然の凍結サンプルおよび緩衝中性ホルマリンで固定した場合にのみ保存されました。強酸性のブアン固定液や緩衝剤を含まないギ酸含有ホルマリンを使用すると、DNA が大幅に失われます。残りの画分は高度に断片化されています。
左側では、フラグメントの長さがキロベースペア (kbp) で表されます。

図2 |核酸ターゲットの完全性の喪失
(a) 両方の鎖の 3'-5' ギャップにより、ターゲット DNA が切断されます。 DNA の合成は依然として小さな断片上で行われます。ただし、DNA 断片にプライマー アニーリング部位が欠落している場合は、線形増幅のみが発生します。最も好ましい場合、フラグメントは互いに再飽和する可能性がありますが、収量は少なく、検出レベルを下回ります。
(b) 主に脱プリンとチミジン二量体形成による塩基の損失は、H 結合の数の減少と Tm の減少につながります。延長された加温段階では、プライマーはマトリックス DNA から溶けて離れ、それほど厳密ではない条件下でもアニールしません。
(c) 隣接するチミン塩基は TT 二量体を形成します。
分子診断でよく発生するもう 1 つの一般的な問題は、フェノール クロロホルム抽出と比較して標的核酸の放出が最適ではないことです。極端な場合、これは偽陰性と関連する可能性があります。細胞破片の煮沸溶解または酵素消化により多くの時間を節約できますが、この方法では核酸の放出が不十分なため、PCR 感度が低下することがよくあります。

増幅中のポリメラーゼ活性の阻害

一般に、阻害は最適ではない PCR 結果をもたらすすべての要因を説明するための概念として使用されます。厳密に生化学的な意味では、阻害は酵素の活性に限定されます。つまり、DNA ポリメラーゼまたはその補因子 (Taq DNA ポリメラーゼの場合は Mg2+) の活性部位との相互作用を介した基質生成物の変換が減少または防止されます。
サンプルまたは試薬を含むさまざまな緩衝液および抽出物中の成分は、酵素を直接阻害したり、その補因子（EDTA など）をトラップしたりするため、ポリメラーゼを不活性化し、PCR 結果の低下または偽陰性の原因となる可能性があります。
ただし、反応成分と標的を含む核酸の間の多くの相互作用は「PCR 阻害剤」とも呼ばれます。分離によって細胞の完全性が破壊され、核酸が放出されると、サンプルとその周囲の溶液および固相との間で相互作用が発生する可能性があります。例えば、「スカベンジャー」は、非共有結合相互作用を通じて一本鎖または二本鎖 DNA に結合し、最終的に PCR 反応容器に到達するターゲットの数を減らすことによって単離と精製を妨害する可能性があります。
一般に、PCR 阻害剤は、臨床診断検査に使用されるほとんどの体液および試薬 (尿中の尿素、血液中のヘモグロビンおよびヘパリン)、栄養補助食品 (有機成分、グリコーゲン、脂肪、Ca2+ イオン)、および環境中の成分 (フェノール) に存在します。 、重金属）

より一般的な PCR 阻害剤は、細菌や真核細胞、非標的 DNA、組織マトリックスの DNA 結合高分子、および手袋やプラスチックなどの実験器具に見られます。抽出中または抽出後の核酸の精製は、PCR 阻害剤を除去するための好ましい方法です。
現在、さまざまな自動抽出装置が多くの手動プロトコルを置き換えることができますが、ターゲットの 100% の回収および/または精製はまだ達成されていません。潜在的な阻害剤が精製核酸中にまだ存在しているか、すでに効果を発揮している可能性があります。阻害剤の影響を軽減するには、さまざまな戦略が存在します。適切なポリメラーゼの選択は、阻害剤の活性に大きな影響を与える可能性があります。 PCR 阻害を軽減する他の実証済みの方法は、ポリメラーゼ濃度を高めるか、BSA などの添加剤を適用することです。
PCR 反応の阻害は、内部プロセス品質管理 (IPC) の使用によって実証できます。
エタノール、EDTA、CETAB、LiCl、GuSCN、SDS、イソプロパノール、フェノールなど、抽出キット内のすべての試薬およびその他の溶液を、徹底的な洗浄ステップによって核酸単離物から除去するように注意する必要があります。濃度に応じて、PCR を活性化または阻害する可能性があります。