PCR反応における干渉因子

PCR反応中に、いくつかの干渉因子がしばしば発生します。
PCRの感度が非常に高いため、汚染はPCRの結果に影響を与える最も重要な要因の1つであると考えられており、誤った陽性の結果を生成する可能性があります。
同様に重要なのは、虚偽の陰性の結果につながるさまざまな情報源です。 PCR混合物の1つ以上の必須部分または増幅反応自体が阻害または干渉される場合、診断アッセイを妨げる可能性があります。これにより、効率が低下し、誤った陰性の結果さえもつながる可能性があります。
阻害に加えて、サンプル調製前の輸送条件や貯蔵条件により、標的核酸の完全性の喪失が発生する可能性があります。特に、高温または不十分な貯蔵は、細胞や核酸の損傷につながる可能性があります。細胞および組織の固定とパラフィン埋め込みは、DNA断片化のよく知られている原因と持続的な問題です（図1および2を参照）。これらの場合、最適な分離と精製でさえも役に立ちません。

図1 | DNAの完全性に対する固定化の効果
アガロースゲル電気泳動は、剖検のパラフィン切片から分離されたDNAの品質が大きく異なることを示した。固定方法に応じて、抽出物には異なる平均フラグメント長のDNAが存在していました。 DNAは、天然の凍結サンプルおよび緩衝液中のニュートラルホルマリンで固定された場合にのみ保存されました。強く酸性のブーイン固定剤または緩衝されていない形成酸含有ホルマリンを使用すると、DNAが大幅に喪失しました。残りの画分は非常に断片化されています。
左側では、フラグメントの長さがキロベースペア（KBP）で表されます

図2 |核酸標的の完全性の喪失
（a）両方のストランドの3'-5 'ギャップは、標的DNAの破損をもたらします。 DNAの合成は、小さなフラグメントで引き続き発生します。ただし、DNAフラグメントにプライマーアニーリング部位が欠落している場合、線形増幅のみが発生します。最も有利なケースでは、フラグメントは互いに再飽和する可能性がありますが、収量は小さく、検出レベルを下回ります。
（b）主に剥離とチミジン二量体形成による塩基の喪失は、H結合の数の減少とTMの減少につながります。細長い温​​暖化段階では、プライマーはマトリックスDNAから離れて溶け、それほど厳しい条件下でもアニールしません。
（c）隣接するチミン塩基はTT二量体を形成します。
分子診断でしばしば発生するもう1つの一般的な問題は、フェノールクロロホルム抽出と比較して、標的核酸の最適ではない放出です。極端な場合、これは偽陰性に関連付けられます。細胞片の溶解または酵素消化を沸騰させることで多くの時間を節約できますが、この方法はしばしば核酸放出が不十分なため、PCR感受性が低くなります。

増幅中のポリメラーゼ活性の阻害

一般に、阻害は、最適ではないPCRの結果につながるすべての要因を記述するための容器の概念として使用されます。厳密に生化学的意味では、阻害は酵素の活性に限定されます。つまり、DNAポリメラーゼまたはその補因子の活性部位との相互作用を介して基質製品の変換を減少または防止します（例えば、Taq DNAポリメラーゼのMg2+）。
試薬を含むさまざまなバッファーおよび抽出物の成分は、酵素を直接阻害またはその補因子（EDTAなど）をトラップし、それによりポリメラーゼを不活性化し、次に減少または偽陰性PCRの結果をもたらします。
ただし、反応成分と標的含有核酸との間の多くの相互作用も「PCR阻害剤」として指定されています。細胞の完全性が分離によって破壊され、核酸が放出されると、サンプルとその周囲の溶液と固相の間の相互作用が発生する可能性があります。たとえば、「スカベンジャー」は、非共有相互作用を介して一本鎖または二本鎖DNAに結合し、最終的にPCR反応容器に到達するターゲットの数を減らすことにより、分離と精製を妨害することができます。
一般に、PCR阻害剤は、臨床診断検査（尿中の尿素、血液中のヘモグロビンおよびヘパリン）、栄養補助食品（有機成分、グリコーゲン、脂肪、Ca2+イオン）、および環境の成分（フェノール、重度））に使用されるほとんどの体液と試薬に存在します。

より一般的なPCR阻害剤は、細菌と真核細胞、非ターゲットDNA、組織マトリックスのDNA結合高分子、および手袋やプラスチックなどの実験装置に見られます。抽出中または抽出後の核酸の精製は、PCR阻害剤を除去するための好ましい方法です。
今日、さまざまな自動抽出装置が多くの手動プロトコルを置き換えることができますが、ターゲットの100％の回復および/または精製は達成されていません。潜在的な阻害剤は、精製された核酸にまだ存在する可能性があるか、すでに有効になっている可能性があります。阻害剤の影響を減らすためにさまざまな戦略が存在します。適切なポリメラーゼの選択は、阻害剤活性に大きな影響を与える可能性があります。 PCR阻害を減らす他の実証済みの方法は、ポリメラーゼ濃度の増加またはBSAなどの添加物の適用です。
PCR反応の阻害は、内部プロセス品質制御（IPC）を使用することにより実証できます。
エタノール、EDTA、CETAB、LICL、GUSCN、SDS、イソプロパノール、フェノールなど、抽出キットのすべての試薬およびその他の溶液を、徹底的な洗浄ステップにより分離段階で分離するように注意する必要があります。濃度に応じて、PCRを活性化または阻害する場合があります。