PCR反応における干渉因子

PCR 反応中に、いくつかの妨害要因に遭遇することがよくあります。
PCR の感度は非常に高いため、汚染は PCR の結果に影響を及ぼす最も重要な要因の 1 つと考えられており、偽陽性の結果が生じる可能性があります。
偽陰性の結果につながる様々な要因も同様に重要です。PCR混合物の1つ以上の重要な部分、あるいは増幅反応自体が阻害されたり妨害されたりすると、診断検査が妨げられる可能性があります。その結果、検査効率が低下し、偽陰性の結果につながることもあります。
阻害に加えて、サンプル調製前の輸送および／または保管条件によって標的核酸の完全性が損なわれる可能性があります。特に、高温または不適切な保管は細胞および核酸の損傷につながる可能性があります。細胞および組織の固定、およびパラフィン包埋は、DNA断片化のよく知られた原因であり、根深い問題となっています（図1および2参照）。このような場合、最適な単離および精製を行っても効果はありません。

図1 | 固定化によるDNAの完全性への影響
アガロースゲル電気泳動の結果、剖検パラフィン切片から単離されたDNAの品質には大きなばらつきがあることが示された。抽出液には、固定方法によって異なる平均断片長のDNAが含まれていた。DNAは、未凍結サンプルおよび緩衝中性ホルマリンで固定した場合にのみ保存された。強酸性ブアン固定液または緩衝化されていないギ酸含有ホルマリンを使用した場合、DNAが大幅に失われた。残りの断片は高度に断片化されていた。
左側では、断片の長さがキロベースペア（kbp）で表されています。

図2 | 核酸標的の完全性の喪失
(a) 両鎖に3'-5'ギャップが存在すると、標的DNAが切断されます。小さな断片上ではDNA合成は依然として起こります。しかし、DNA断片上にプライマーアニーリング部位が欠落している場合、線形増幅のみが起こります。最も好ましいケースでは、断片は互いに再飽和する可能性がありますが、その収量は少なく、検出限界以下となります。
(b) 主に脱プリン化とチミジン二量体形成による塩基の損失は、水素結合数の減少とTm値の低下につながる。伸長加熱段階の間、プライマーはマトリックスDNAから融解し、より緩やかな条件下でもアニールしなくなる。
（c）隣接するチミン塩基はTT二量体を形成する。
分子診断においてしばしば発生するもう一つの一般的な問題は、フェノール-クロロホルム抽出法と比較して標的核酸の遊離が不十分であることです。極端な場合には、偽陰性につながる可能性があります。煮沸溶解法や細胞破片の酵素消化法によって時間を大幅に節約できますが、これらの方法では核酸の遊離が不十分なため、PCR感度が低下することがよくあります。

増幅中のポリメラーゼ活性の阻害

一般的に、阻害はPCR結果の最適化を妨げるあらゆる要因を包括する概念として用いられます。厳密に生化学的に言えば、阻害は酵素の活性に限定され、DNAポリメラーゼの活性部位またはその補因子（例えば、Taq DNAポリメラーゼの場合はMg2+）との相互作用を通じて基質-生成物変換を低下または阻害します。
サンプル内の成分や試薬を含むさまざまな緩衝液や抽出物は、酵素を直接阻害したり、酵素の補因子（EDTA など）を捕捉したりして、ポリメラーゼを不活性化し、PCR 結果の低下や偽陰性につながる可能性があります。
しかしながら、反応成分と標的核酸との間の多くの相互作用は、「PCR阻害物質」とも呼ばれています。分離によって細胞の完全性が損なわれ、核酸が放出されると、サンプルと周囲の溶液および固相との間で相互作用が発生する可能性があります。例えば、「スカベンジャー」は非共有結合的な相互作用によって一本鎖または二本鎖DNAに結合し、最終的にPCR反応容器に到達する標的の数を減らすことで、分離と精製を阻害します。
一般的に、PCR阻害物質は、臨床診断検査に使用されるほとんどの体液および試薬（尿中の尿素、血液中のヘモグロビンおよびヘパリン）、栄養補助食品（有機成分、グリコーゲン、脂肪、Ca2+イオン）、および環境中の成分（フェノール、重金属）に存在します。

PCR阻害物質は、細菌や真核細胞、非標的DNA、組織マトリックス中のDNA結合高分子、手袋やプラスチックなどの実験器具などに存在する場合が多く見られます。PCR阻害物質を除去するには、抽出中または抽出後に核酸を精製することが推奨されます。
今日では、様々な自動抽出装置が多くの手動プロトコルに取って代わっていますが、標的の100%の回収および／または精製は未だ達成されていません。潜在的な阻害物質は精製された核酸中に依然として存在しているか、すでに作用している可能性があります。阻害物質の影響を軽減するための様々な戦略が存在します。適切なポリメラーゼの選択は、阻害物質の活性に大きな影響を与える可能性があります。PCR阻害を軽減する他の実証済みの方法としては、ポリメラーゼ濃度の上昇やBSAなどの添加剤の適用が挙げられます。
PCR 反応の阻害は、内部プロセス品質管理 (IPC) の使用によって実証できます。
抽出キットに含まれるエタノール、EDTA、CETAB、LiCl、GuSCN、SDS、イソプロパノール、フェノールなどの試薬やその他の溶液は、核酸単離物から徹底的に洗浄して除去する必要があります。これらの濃度によっては、PCRを活性化または阻害する可能性があります。