エチオピアにおけるSARS-CoV-2の同定のための4つの核酸増幅検査の実施

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2019年のコロナウイルス感染症（COVID-19）の発生以来、世界中で多くの市販の核酸増幅検査（NAAT）が開発され、標準的な検査法となっています。いくつかの検査は急速に開発され、臨床診断検査に適用されましたが、これらの検査の性能はさまざまな設定で評価されていません。そのため、本研究では、複合参照標準（CRS）を使用して、Abbott SARS-CoV-2、Daan Gene、BGI、およびSansure Biotechのアッセイの性能を評価することを目的としました。本研究は、2020年12月1日から30日まで、エチオピア公衆衛生研究所（EPHI）で実施されました。QIAamp RNAミニキットとAbbott DNAサンプル調製システムを使用して、164の鼻咽頭サンプルを抽出しました。164の検体のうち、59.1％がCRS陽性、40.9％が陰性でした。 Sansure Biotech の陽性率は CRS と比較して有意に低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech の陽性率は CRS と比較して有意に低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech が CRS を評価した (p < 0,05)。 Sansure Biotech の陽性結果は CRS と比較して大幅に低かった (p < 0.05)。Sansure Biotech の耐性率は CRS と比べて低かった (p < 0.05)。Sansure Biotech の耐性率は CRS と比べて低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech は、CRS を評価しました (p < 0,05)。 Sansure Biotech は CRS と比較して有意に少ない陽性結果を示しました (p < 0.05)。4つの分析法の全体的な一致率は、CRSと比較して96.3～100%でした。Sansure Biotech社のアッセイの陽性率は低かったものの、4つのアッセイの性能はほぼ同等でした。そのため、Sansure Biotech社の[研究専用（RUO）]アッセイをエチオピアで使用するには、追加の検証が必要です。最後に、適切な製造業者の主張に基づくアッセイを評価するために、追加の研究を検討する必要があります。
臨床検査は、世界保健機関（WHO）の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）への備えと対応に関する戦略計画（SPRP）の一部です。WHOは、各国に対し、公衆衛生上の課題への備え、適切な症例管理、警戒、迅速な対応を向上させるために、臨床検査の能力強化を図るよう勧告しています。これは、臨床検査が新興感染症の疾患と疫学の特徴を明らかにし、その蔓延を抑制する上で重要な役割を担っていることを示唆しています。
COVID-19の診断には、疫学的および医学的情報、個人の症状/徴候、ならびにレントゲン写真および臨床検査データが必要である2。中国武漢でCOVID-19の発生が報告されて以来、世界中で多くの市販の核酸増幅検査（NAAT）が開発されている。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（rRT-PCR）は、重症急性呼吸器症候群2（SARS-CoV-2）3感染の臨床診断のための日常的かつ標準的な方法として使用されている。SARS-CoV-2の分子検出は、通常、ウイルスゲノムから特定されたORF1a/b（オープンリーディングフレーム1a/b）遺伝子領域にあるN（ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子）、E（エンベロープタンパク質遺伝子）、およびRdRp（RNA依存性RNAポリメラーゼ遺伝子）遺伝子に基づいている。これらの遺伝子のうち、RdRp 遺伝子と E 遺伝子は分析検出感度が高く、N 遺伝子は分析感度が低い5。
PCR検査の性能は、抽出試薬、増幅/検出試薬、抽出方法、PCR装置やその他の機器の品質など、さまざまな要因によって異なります。2020年4月現在、9か国から48種類以上の診断機器がCOVID-19診断のための緊急使用許可（EUA）を取得しています。エチオピアでは、ABI 7500、Abbott m2000、Roche 48000、Quant-studio7など、14種類以上のリアルタイムPCRプラットフォームが26の公衆衛生機関でSARS-CoV-2のPCR検出に使用されています。さらに、Daan Gene検査、Abbott SARS-CoV-2検査、Sansure Biotech検査、SARS-CoV-2 BGI検査など、さまざまなPCR検査キットが利用可能です。 rRT-PCR は非常に感度が高いが、COVID-19 患者の中には、不適切な採取、輸送、保管および取り扱い、ならびに検査室での検査条件および職員の行動により、検体中のウイルスリボ核酸 (RNA) のコピー数が不十分なために偽陰性の結果を報告する者もいる8。さらに、検体またはコントロールの取り扱いミス、サイクル閾値 (Ct) の設定、および他の病原性核酸または不活性/残留 SARS-CoV-2 RNA との交差反応性が、rRT-PCR9 アッセイで偽陽性の結果につながる可能性がある。したがって、PCR 検査では実際に遺伝子断片のキャリアを特定できることは明らかであるが、真に活性なウイルス遺伝子を区別することすらできないため、検査ではキャリアのみを特定でき、患者を特定できない10。したがって、われわれの環境では標準的な方法を用いて診断性能を評価することが重要である。エチオピア公衆衛生研究所 (EPHI) および全国で多くの NAAT 試薬が利用可能であるが、それらの有効性の比較評価はまだ報告されていない。したがって、本研究は、臨床検体を用いたrRT-PCRによるSARS-CoV-2の検出に市販されているキットの比較性能を評価することを目的とした。
本研究には、COVID-19の疑いのある参加者164名が含まれました。サンプルの大部分は治療センター（118/164 = 72%）から採取されたもので、残りの46名（28%）は非治療センターから採取されました。センターで治療を受けなかった参加者のうち、15名（9.1%）は臨床的に疑いのある症例であり、31名（18.9%）は確定症例との接触歴がありました。参加者の93名（56.7%）は男性で、平均年齢（±SD）は31.10歳（±11.82歳）でした。
本研究では、COVID-19の4つの検査の陽性率と陰性率を測定した。アボット社のSARS-CoV-2検査、ダーアンジーン社の2019-nCoV検査、SARS-CoV-2 BGI検査、サンシュアバイオテック社の2019-nCoV検査の陽性率はそれぞれ59.1%、58.5%、57.9%、55.5%であった。複合参照標準（CRS）スコアの陽性および陰性はそれぞれ97（59.1%）、67（40.9%）であった（表1）。本研究では、CRSの定義は「いずれか陽性」ルールに基づいており、4つの検査結果のうち、同じ結果を示す2つ以上の検査結果を真陽性または真陰性とみなした。
本研究では、CRSと比較した全ての分析において、陰性一致率（NPA）は100%（95%信頼区間94.6～100）でした。Sansure Biotechnologyの分析ではPPAが93.8%（95%信頼区間87.2～97.1）と最も低く、Daan Gene 2019-nCoVの分析では99.4%（95%信頼区間96.6～99.9）の全体一致率を示しました。一方、SARS-CoV-2 BGIアッセイとSansure Biotech 2019-nCoVアッセイの全体一致率はそれぞれ98.8%と96.3%でした（表2）。
CRSとアボットSARS-CoV-2検査結果のCohenのκ係数は完全に一致しました（K = 1.00）。同様に、Daan Gene 2019-nCoV、SARS-CoV-2 BGI、およびSansure Biotech 2019-nCoVで検出されたCohenのκ係数もCRSと完全に一致しました（K ≥ 0.925）。この比較分析において、カイ二乗検定（McNemar検定）の結果、Sansure Biotech 2019-nCoV検査結果はCRS結果と有意に異なることが示されました（p = 0.031）（表2）。
図に示すように1 Abbott SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp と N 遺伝子の組み合わせ) の最低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合は 87.6% であり、Sansure Biotech 2019-nCoV アッセイの ORF1a/b 遺伝子 Ct 値は、低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合が 50.3%、高 Ct 値 (36–40 Ct) が 3.2% であることが示されました。 1 Abbott SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp と N 遺伝子の組み合わせ) の最低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合は 87.6% であり、Sansure Biotech 2019-nCoV アッセイの ORF1a/b 遺伝子 Ct 値は、低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合が 50.3%、高 Ct 値 (36–40 Ct) が 3.2% であることが示されました。図に示すように1、Ct (< 20 Ct) анализа アボット SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а Ct (36–40)中央値) 3.2%。 1、アボットSARS-CoV-2（RdRpとNの複合遺伝子）の解析で最低Ct値（< 20 Ct）の割合は87.6%であり、サンシュアバイオテック2019-nCoVのORF1a/b遺伝子の解析で低Ct値（< 20 Ct）の割合は50.3%を占め、高Ct値（36〜40 Ct）は3.2%を占めていることが示されました。図1に示すように、Abbott SARS-CoV-2検査（RdRpとN遺伝子の結合）の最小Ct値百分率（< 20 Ct）は87.6%で、Sansure Biotech 2019-nCoV検査のORF1a/b遺伝子Ct値は低いCtを示したCt 値 (< 20 Ct) の割合は 50.3%、高 Ct 値 (36 ～ 40 Ct) の割合は 3.2% でした。 図1に示すように、Abbott SARS-CoV-2検査(RdRpとN遺伝子の組み合わせ)の最低Ct値の割合(< 20 Ct)は87.6%であり、Sansure Biotech 2019-nCoV検査のORF1a/b遺伝子のCt値は、低Ct値(< 20 Ct)の割合は50.3%、高Ct値(36–40 Ct)の割合は3.2%を示しています。 Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) 87,6%、Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. 図 1 に示すように、Abbott SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp 遺伝子と N 遺伝子の組み合わせ) は Ct 値のパーセンテージ (< 20 Ct) が 87.6% と最も低く、Sansure Biotech 2019 研究の nCoV の分析では ORF1a/b 遺伝子の Ct 値が低いことが示されました。 平均価格は 20 セント (< 20 セント) で 50,3%、平均で 36–40 セント (36–40 セント) は 3,2% です。 （Ct値<20）の割合は50.3％で、高Ct値（Ct値36〜40）の割合は3.2％でした。アボットのSARS-CoV-2 B検査では、30を超えるCt値が記録されました。 一方、BGI SARS-CoV-2アッセイではORF1a/b遺伝子は高いCt値（> 36 Ct）を示し、その割合は4%でした（図1）。 一方、BGI SARS-CoV-2アッセイではORF1a/b遺伝子は高いCt値（> 36 Ct）を示し、その割合は4%でした（図1）。 BGI SARS-CoV-2 の検査結果は ORF1a/b で、Ct (> 36 Ct)、平均 4% です。 (1)。 一方、BGIの解析ではSARS-CoV-2遺伝子ORF1a/bは高いCt値（> 36 Ct）を示し、その割合は4%でした（図1）。一方、BGI SARS-CoV-2 検査では、ORF1a/b 遺伝子の割合は 4% の高い Ct 値（> 36 Ct）でした（図 1）。 一方、BGI SARS-CoV-2検出では、高Ct値（> 36 Ct）のORF1a/b遺伝子の割合は4％でした（図1）。 BGI SARS-CoV-2 の検査結果は、ORF1a/b で Ct (>36 Ct) 4% (1) でした。 一方、BGI SARS-CoV-2解析では、高Ct値（>36 Ct）を示すORF1a/b遺伝子の割合は4%でした（図1）。
本研究では、164個の鼻咽頭検体を採取しました。全ての検査において、RNAの分離と増幅は、それぞれの製造業者が推奨する方法とキットを用いて実施しました。
この研究では、アボットの SARS-CoV-2 検査が CRS と同じ検出性能を持ち、陽性、陰性、および全体的な一致が 100% であることが実証されました。コーエンのカッパ一致は 1.00 で、CRS と完全に一致することを示しています。米国ワシントン大学による同様の研究では、CDC の実験室決定アッセイ (LDA) と比較して、アボットの SARS-CoV-2 検査の全体的な感度と特異度はそれぞれ 93% と 100% であることがわかりました。11。アボットの SARS-CoV-2 検出システムは、N 遺伝子と RdRp 遺伝子の同時検出に基づいています。両方の遺伝子がより感度が高いため、偽陰性が最小限に抑えられます12。オーストリアのウィーンで行われた研究でも、抽出サンプル量と検出溶出液量が多いと希釈効果が最小限に抑えられ、検出効率が向上することが示されました13。したがって、アボットの SARS-CoV-2 アッセイに最適な組み合わせは、コンビナトリアル遺伝子の検出、大量のサンプル (0.5 ml) の抽出、および大量の溶出液 (40 µl) の使用を同時に行うプラットフォーム検出システムと組み合わせることができます。
また、Daan遺伝子検査の検出性能はCRSとほぼ同等であることが示されました。これは、中国淮南省の安徽大学で実施された研究14およびメーカーによる100%陽性一致の主張と一致しています。一貫した結果が報告されているにもかかわらず、1つのサンプルは同じ溶出液の再検査で偽陰性となり、Abbott SARS-CoV-2およびSansure Biotech nCoV-2019検査では陽性となりました。これは、異なる種類の検査間で結果にばらつきがある可能性があることを示唆しています。 しかしながら、中国で実施された研究15では、Daan Gene アッセイの結果は、研究室で定義された参照アッセイと比較して有意に異なっていました (p < 0.05)。 しかしながら、中国で実施された研究15では、Daan Gene アッセイの結果は、研究室で定義された参照アッセイと比較して有意に異なっていました (p < 0.05)。 Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа。 しかし、中国での研究15では、Daan Geneの分析結果が、同社の検査機関による参照分析結果と大幅に異なっていました（p < 0.05）。しかしながら、中国で行われた研究15では、大遺伝子検査の結果は、他の実験室で設定された基準検査と比べて大きな差があった(p < 0.05)。しかし、中国で行われた研究では 15、大安遺伝子検査の結果は、他の試験室で設定された基準検査と比較して <0.05 の差がありました。 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. しかし、中国での研究15では、Daanの遺伝子検査の結果は、参照となる実験室の検査結果と比較して有意に異なっていました（p < 0.05）。この矛盾は、SARS-CoV-2 を検出するための参照検査の感度によるものである可能性があり、原因を特定するにはさらなる研究が重要となる可能性があります。
さらに、当研究では、SARS-CoV-2 BGIアッセイとCRSの比較性能を評価し、優れた陽性一致率（PPA = 97.9%）、陰性一致率（NPA = 100%）、および性別による全体的な一致率（OPA）を示しました。 = 98.8%。コーエンのカッパ値は良好な一致を示しました（K = 0.975）。オランダ16と中国15の研究では、一貫した結果が示されています。SARS-CoV-2 BGIテストは、10µlの増幅/検出溶出液を使用する単一遺伝子（ORF1a / b）検出テストです。当社の参照結果との統計的に良好な一致にもかかわらず、分析では全サンプルのうち2つの陽性サンプル（1.22%）を見逃しました。これは、患者レベルとコミュニティレベルの両方で、伝播の動態に大きな臨床的影響を与える可能性があります。
本研究に含まれたもう一つの比較解析は、Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR（RUO）アッセイであり、全体の一致率は96.3%でした。一致の強さはCohen's Kappa値によっても決定され、0.925となり、CRSと完全に一致することを示しています。繰り返しますが、私たちの結果は、中国長沙の中南大学および中国柳州市の柳州人民病院臨床検査部で実施された研究と一致しています17。 上記のように良好な統計的一致が記録されたにもかかわらず、カイ二乗検定 (MacNemar 検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果は CRS と比較して統計的に有意な差があることが示されました (p < 0.005)。 上記のように良好な統計的一致が記録されたにもかかわらず、カイ二乗検定 (MacNemar 検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果は CRS と比較して統計的に有意な差があることが示されました (p < 0.005)。 Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выгее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005）。 上記では良好な統計的一致が記録されましたが、カイ二乗検定 (マクネマー検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果が CRS と比較して統計的に有意な差があることが示されました (p < 0.005)。前述の良好な一致性が認められたにもかかわらず、サンシュア・バイオテックの検査結果はCRSと比較して臨床的な差があることが示された（p < 0.005）。上記の良好な一致性は認められましたが、しかし、検査（（マクネマー検査は、サンシュアバイオテクノロジーの検査結果が crs と比較して優れていることを示しました（（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。））） Несмотря на отмеченное статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) Sansure Biotech と CRS の結果 (p < 0,005)。 上記の良好な統計的一致にもかかわらず、カイ二乗検定 (マクネマー検定) では、Sansure Biotech アッセイと CRS の間に統計的に有意な差 (p < 0.005) が示されました。CRSと比較して、6つのサンプル（3.66%）が偽陰性であることが判明しました（補足表1）。これは、特にウイルスの伝播の動態を考慮すると非常に重要です。上記のデータも、この低い検出率を裏付けています15。
この研究では、各アッセイおよびそれぞれのプラットフォームについてCt値が決定され、アボットSARS-CoV-2アッセイで報告された平均Ct値が最も低かった。この結果は、SARS-CoV-2の検出のためのアボットの同時複合遺伝子検査システムに関係している可能性がある。したがって、図1によれば、アボットSARS-CoV-2結果の87.6％はCt値が20未満であった。少数のサンプル結果（12.4％）のみが20〜30の範囲にあった。30を超えるCt値は記録されなかった。アボットがSARS-CoV-2パネル遺伝子検査形式を使用していることに加えて、この結果は、同社の下限値100 RNAコピー/mLの3倍低い検出下限値（32.5 RNAコピー/mL）18に関連している可能性がある。
本研究にはいくつかの限界があります。第一に、リソース不足のため、標準的／参照的な方法（ウイルス量やその他の臨床検査（LDA）など）が確立されていません。第二に、本研究で使用した検体はすべて鼻咽頭スワブであり、その結果は他の種類の検体には適用できません。第三に、サンプル数が少なかったことです。
本研究では、鼻咽頭検体を用いたSARS-CoV-2の検出において、4種類のrRT-PCR検査の性能を比較しました。Sansure Biotech社の検査を除き、全ての検査はほぼ同等の性能を示しました。 さらに、Sansure Biotech アッセイでは CRS と比較して低い陽性率が確認されました (p < 0.05)。 さらに、Sansure Biotech アッセイでは CRS と比較して低い陽性率が確認されました (p < 0.05)。 Sansure Biotech が CRS を取得したことを確認しました (p < 0,05)。 さらに、Sansure Biotech の検査では CRS と比較して陽性結果の割合が低かった (p < 0.05)。さらに、Sansure Biotech の検査では CRS と比較して低かった (p < 0.05)。さらに、Sansure Biotech の検査では CRS と比較して低かった (p < 0.05)。 サンシュア バイオテック社は、CRS の研究を行っています (p < 0,05)。 さらに、Sansure Biotech のアッセイでは CRS と比較して陽性率が低かった (p < 0.05)。Sansure Biotech社のnCoV-2019（RUO）アッセイは、PPA、NPA、および全体的一致において93.5%を超え、Cohen Kappaの一致強度は0.925でした。最後に、Sansure Biotechアッセイ（RUO）はエチオピアでの使用に向けてさらなる検証が必要であり、個々の製造業者の主張を評価するための追加研究を検討する必要があります。
比較研究設計は、アディスアベバの4つの医療施設、エカ・コテベ病院、ミレニアム教会治療センター、ゼウディトゥ記念病院、聖ペテロ結核専門病院で実施されました。データは2020年12月1日から31日まで収集されました。本研究のための医療施設は、症例数が多く、市内に主要な治療センターがあることを理由に意図的に選ばれました。同様に、ABI 7500やアボットm2000リアルタイムPCR装置などの機器は、NAAT試薬メーカーの推奨に従って選択され、エチオピアのほとんどの検査室が少なくとも4つは使用していたため、本研究では4つのPCR検出キットが選択されました。研究期間中、遺伝子検査、アボットSARS-CoV-2検査、サンシュアバイオテック検査、およびSARS-CoV-2 BGI検査が実施されました。
2020年12月1日から30日まで、EPHIに紹介されたCOVID-19の調査対象者から3 mlのウイルス輸送培地（VTM）（Miraclean Technology、中国、深圳）を使用してSARS-CoV-2の検査を実施した。訓練を受けた検体採取者が鼻咽頭検体を採取し、3個パックでEPHIに送付した。核酸分離に先立ち、各検体に固有の識別番号が割り当てられる。到着後すぐに、手動および自動抽出法を用いて各検体から抽出が行われた。したがって、Abbott m2000の自動抽出では、各検体から1.3 ml（デッドボリューム0.8 mlと抽出入口ボリューム0.5 mlを含む）の検体を抽出し、Abbott DNAサンプル調製システム（Abbott Molecular Inc.、米国イリノイ州デスプレーンズ）に通した。 ) 96 のバッチ [92 のサンプル、2 つの検出コントロール、2 つの非テンプレート コントロール (NTC)] が、2 ラウンドの SARS-CoV-2 (EUA) のリアルタイム マイニングの全体的なプロセス (取得および検出) に含まれていました。同様に、手動抽出では、同じサンプルを使用します (自動抽出および検出用)。したがって、プロセス全体を通して、140 µl のサンプルが 9 ラウンドにわたって 24 のバッチ (20 のサンプル、2 つのアッセイ コントロール、2 つの NTC を含む) で QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH、ドイツ、ヒルデン) を使用して等分され、抽出されました。手動で抽出された溶出液は、ABI 7500 サーマル サイクラーを使用して、SARS-CoV-2 BGI アッセイ、Daan Gene アッセイ、および Sansure Biotech アッセイを使用して増幅および検出されました。
SARS-CoV-2ウイルスRNAの自動分離・精製は、アボットDNAサンプル調製試薬を用いた磁気ビーズ原理に基づいている。サンプルの不活化とウイルス粒子の可溶化は、タンパク質を変性させRNaseを不活化するグアニジンイソチオシアネートを含む洗剤を用いて行われる。その後、RNAはシリカを用いた固相分離によってタンパク質から分離される。すなわち、グアニジン塩と溶解バッファーのアルカリ性pHが核酸とシリカ（SiO2）の結合を促進する。洗浄工程で残留タンパク質と残骸が除去され、透明な溶液が生成される。透明なRNAは、機器の磁場を用いてシリカベースの微粒子から分離される20,21。一方、RNAの手動分離・精製は、磁気スタンドの代わりに遠心分離を用いたスピンカラム法と、溶出液から微粒子を分離することによって行われる。
Abbott リアルタイム SARS-CoV-2 検出テスト (Abbott Molecular, Inc.) は、WHO および FDA から EUA19,22 を取得した製造元の指示に従って実施しました。このプロトコルでは、抽出前のサンプル不活化を 56 °C のウォーターバスで 30 分間行いました。ウイルス不活化後、Abbott m2000 DNA サンプル調製システムを使用して、Abbott m2000 SP 機器で 0.5 ml VTM から核酸抽出を行ないました。製造元の指示に従って。増幅と検出は Abbott m2000 RT-PCR 機器を使用して実施し、RdRp 遺伝子と N 遺伝子の二重検出を行ないました。内部コントロールの標的化と検出には、ROX) と VIC P (独自の染料) を使用し、両方の増幅産物の同時検出を可能にしました 19 。
本キットの増幅検出法は、ワンステップRT-PCR技術に基づいています。Daan Gene Technology社は、ORF1a/b遺伝子とN遺伝子を保存領域として選定し、標的領域の増幅を検出しました。サンプル中のSARS-CoV-2 RNAを検出するために、特異的プライマーと蛍光プローブ（FAM標識のN遺伝子プローブ、VIC標識のORF1a/bプローブ）を設計しました。最終的な溶出液とマスターミックスは、マスターミックス20µLに溶出液5µLを加え、最終容量25µLにすることで調製しました。増幅と検出は、ABI 750024リアルタイムPCR装置で同時に実施しました。
ORF1a/bおよびN遺伝子は、Sansure Biotech nCoV-2019核酸診断キット（蛍光PCR検出）を用いて検出しました。ORF1a/b領域にはFAMチャネル、N遺伝子にはROXチャネルを選択し、各標的遺伝子に特異的なプローブを調製しました。本アッセイキットに溶出液とマスターミックス試薬を以下のように添加します。検出/増幅用に、マスターミックス試薬30µLと溶出サンプル20µLを調製します。増幅/検出には、リアルタイムPCR ABI 750025を使用しました。
SARS-CoV-2 BGI検査は、COVID-19診断用の蛍光リアルタイムrRT-PCRキットです。標的領域はSARS-CoV-2ゲノムのORF1a/b領域に位置し、単一遺伝子検出法です。また、ヒトハウスキーピング遺伝子β-アクチンは内部調節標的遺伝子です。マスターミックスは、マスターミックス試薬20µlと抽出したRNAサンプル10µlをウェルプレート26で混合して調製します。増幅および検出には、ABI 7500蛍光定量リアルタイムPCR装置を使用しました。すべての核酸増幅、各アッセイのPCR実行条件、および結果の解釈は、それぞれの製造元の指示に従って実施しました（表3）。
この比較分析では、4 つの分析の一致率（陽性、陰性、全体）やその他の比較パラメータを決定するために参照標準法は使用しませんでした。各テストの比較は CRS を使用して行われました。この研究では、CRS は「任意の陽性」というルールによって設定され、結果は単一のテストではなく、少なくとも 2 つの一致したテスト結果を使用して決定されました。さらに、COVID-19 の伝染の場合、偽陰性の結果は偽陽性の結果よりも危険です。したがって、CRS 結果からできるだけ正確に「陽性」と言うには、少なくとも 2 つのアッセイ テストが陽性である必要があります。つまり、少なくとも 1 つの陽性結果は EUA アッセイから得られる可能性があります。したがって、4 つのテスト結果のうち、同じ結果を示す 2 つ以上のテスト結果が真陽性または陰性と見なされます18,27。
データは構造化データ抽出フォームを用いて収集され、データ入力と分析はExcel統計ソフトウェアとSPSSバージョン23.0を用いて記述統計的に実施されました。肯定的、否定的、および全体的な一致率を分析し、各手法とCRSの一致度をカッパスコアを用いて判定しました。カッパ値は以下のように解釈されます：軽度一致は0.01～0.20、全般的一致は0.21～0.40、中等度一致は0.41～0.60、高度一致は0.61～0.80、完全一致は0.81～0.99。
アディスアベバ大学から倫理審査を受け、本研究のすべての実験プロトコルはエチオピア公衆衛生研究所（EPHI）の科学倫理審査委員会によって承認されました。EPHI倫理ライセンスの参照番号はEPHI/IRB-279-2020です。すべての研究方法は、エチオピアのCOVID-19治療に関する包括的国家ガイドラインの推奨事項と規定に従って実施されました。また、本研究への参加に先立ち、すべての研究参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得ました。
本研究で取得または分析されたすべてのデータは、本論文に含まれています。本研究の結果を裏付けるデータは、各著者に合理的な請求があれば入手可能です。
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