エチオピアにおける SARS-CoV-2 を特定するための 4 つの核酸増幅アッセイの実施

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2019 年のコロナウイルス感染症 (COVID-19) の発生以来、多くの商用核酸増幅検査 (NAAT) が世界中で開発され、標準的なアッセイとなっています。いくつかのテストが迅速に開発され、臨床検査での診断テストに適用されましたが、これらのテストのパフォーマンスはさまざまな設定で評価されていません。したがって、この研究は、複合参照標準（CRS）を使用して、アボット SARS-CoV-2、Daan Gene、BGI、および Sansure Biotech アッセイのパフォーマンスを評価することを目的としました。この研究は、2020年12月1日から30日までエチオピア公衆衛生研究所（EPHI）で実施されました。QIAamp RNAミニキットとアボットDNAサンプル調製システムを使用して、164個の鼻咽頭サンプルが抽出されました。 164 の検体のうち、59.1% が CRS 陽性、40.9% が陰性でした。 Sansure Biotech の陽性率は CRS と比較して有意に低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech の陽性率は CRS と比較して有意に低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech が CRS を評価した (p < 0,05)。 Sansure Biotech の肯定的な結果は、CRS と比較して有意に低かった (p < 0.05)。Sansure Biotech の耐性率は CRS と比べて低かった (p < 0.05)。Sansure Biotech の耐性率は CRS と比べて低かった (p < 0.05)。 Sansure Biotech は、CRS を評価しました (p < 0,05)。 Sansure Biotech では、CRS と比較して陽性結果が有意に少なかった (p < 0.05)。4 つの分析の全体的な一致率は、CRS と比較して 96.3 ～ 100% でした。 Sansure Biotech アッセイの陽性率が低いことに加えて、4 つのアッセイのパフォーマンスはほぼ同等でした。そのため、Sansure Biotech [Research Only (RUO)] アッセイをエチオピアで使用するには追加の検証が必要です。最後に、適切なメーカーの主張を伴うアッセイを評価するために、追加の研究を考慮する必要があります。
臨床検査は、世界保健機関 (WHO) の 2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) の準備と対応 (SPRP) 戦略計画の一部です。 WHOは各国が公衆衛生上の課題への備え、適切な症例管理、警戒心、迅速な対応を改善するために検査能力を構築する必要があると勧告している。これは、研究所の役割が新興感染性病原体の疾患と疫学を特徴づけ、その蔓延を制御する鍵であることを示唆しています。
新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の診断には、疫学情報と医学情報、個人の症状/徴候、X線写真と検査データが必要です2。中国の武漢で新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の発生が報告されて以来、世界中で多くの商用核酸増幅検査（NAAT）が開発されてきました。リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (rRT-PCR) は、重症急性呼吸器症候群 2 (SARS-CoV-2)3 感染症の検査室診断のための日常的かつ標準的な方法として使用されています。 SARS-CoV-2 の分子検出は通常、ORF1a/b (オープンリーディングフレーム 1a/b) の N (ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子)、E (エンベロープタンパク質遺伝子)、および RdRp (RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ遺伝子) 遺伝子に基づいています。 。遺伝子）ウイルスゲノムから特定された領域。これらは、ウイルス認識のためにウイルスゲノムに見られる主要な保存領域であると考えられています4。これらの遺伝子のうち、RdRp 遺伝子と E 遺伝子は分析検出感度が高く、N 遺伝子は分析感度が低い5。
PCR アッセイの性能は、抽出試薬、増幅/検出試薬、抽出方法、PCR マシンやその他の機器の品質などのさまざまな要因によって異なります。 2020 年 4 月の時点で、9 か国の 48 種類以上の診断装置が、新型コロナウイルス感染症 (COVID-196) の診断のために緊急使用許可 (EUA) を取得しています。エチオピアでは、ABI 7500、Abbott m2000、Roche 48000、Quant-studio7 を含む 26 の公衆衛生機関で、14 を超えるリアルタイム PCR プラットフォームが SARS-CoV-2 の PCR 検出に使用されています。また、Daan Gene検査、Abbott SARS-CoV-2検査、Sansure Biotech検査、SARS-CoV-2 BGI検査など、各種PCR検査キットも用意しております。 rRT-PCR は感度が高いものの、一部の COVID-19 患者は、不適切な収集、輸送、保管および取り扱い、臨床検査でサンプル中のウイルス リボ核酸 (RNA) のコピーが不十分なため、偽陰性結果を報告します。職員の状況と行動8．さらに、サンプルまたはコントロールの誤った取り扱い、サイクル閾値（Ct）の設定、他の病原性核酸または不活性/残留 SARS-CoV-2 RNA との交差反応性により、rRT-PCR9 アッセイで偽陽性の結果が生じる可能性があります。したがって、PCR 検査は実際に遺伝子断片の保因者を特定できることは明らかです。PCR 検査では真に活性なウイルス遺伝子を区別することさえできないため、この検査では保因者のみを特定でき、患者は特定できません10。したがって、私たちの環境で標準的な方法を使用して診断パフォーマンスを評価することが重要です。多くの NAAT 試薬がエチオピア公衆衛生研究所 (EPHI) および全国で入手可能ですが、それらの有効性の比較評価はまだ報告されていません。したがって、この研究は、臨床検体を使用したrRT-PCRによるSARS-CoV-2の検出のための市販キットの比較性能を評価することを目的とした。
この研究には、新型コロナウイルス感染症の疑いがある合計164人の参加者が含まれていた。サンプルの大部分は治療センターからのものでした（118/164 = 72%）が、残りの 46 名（28%）の参加者は治療センター以外からのものでした。センターで治療を受けなかった参加者のうち、15人（9.1％）が臨床的に感染が疑われる症例を有し、31人（18.9％）が確定症例との接触者であった。 93 名 (56.7%) の参加者は男性で、参加者の平均 (± SD) 年齢は 31.10 (± 11.82) 歳でした。
この研究では、COVID-19 の 4 つの検査の陽性率と陰性率が決定されました。したがって、Abbott SARS-CoV-2 アッセイ、Daan Gene 2019-nCoV アッセイ、SARS-CoV-2 BGI アッセイ、および Sansure Biotech 2019-nCoV アッセイの陽性率は、それぞれ 59.1%、58.5%、57.9%、および 55.5% でした。 。陽性および陰性複合参照標準 (CRS) スコアは、それぞれ 97 (59.1%) および 67 (40.9%) でした (表 1)。この研究では、CRS の定義は「任意の陽性」ルールに基づいており、4 つの検査結果のうち、同じ結果が得られた 2 つ以上の検査結果が真の陽性または陰性と見なされます。
この研究では、CRSと比較したすべての分析で100％（95％CI 94.6-100）の陰性一致率（NPA）が判明しました。 Sansure Biotechnology 分析では、最小 PPA 93.8% (95% CI 87.2-97.1) が示され、Daan Gene 2019-nCoV 分析では全体として 99.4% (95% CI 96.6-99.9) の一致が見られました。対照的に、SARS-CoV-2 BGI アッセイと Sansure Biotech 2019-nCoV アッセイの間の全体的な一致は、それぞれ 98.8% と 96.3% でした (表 2)。
CRS とアボットの SARS-CoV-2 アッセイ結果の間のコーエンのカッパ一致係数は完全に一致していました (K = 1.00)。同様に、Daan Gene 2019-nCoV、SARS-CoV-2 BGI、Sansure Biotech 2019-nCoV によって検出されたコーエンのカッパ値も CRS と完全に一致しています (K ≥ 0.925)。この比較分析では、カイ二乗検定 (マクネマー検定) により、Sansure Biotech 2019-nCoV アッセイ結果が CRS 結果と大きく異なることが示されました (p = 0.031) (表 2)。
図に示すように。1 アボット SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp と N 遺伝子の組み合わせ) の最低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合は 87.6% であり、サンシュア バイオテック 2019-nCoV アッセイの ORF1a/b 遺伝子 Ct 値の割合は低いことが示されました。 Ct 値 (< 20 Ct) は 50.3% で、高い Ct 値 (36 ～ 40 Ct) は3.2%。 1 アボット SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp と N 遺伝子の組み合わせ) の最低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合は 87.6% であり、サンシュア バイオテック 2019-nCoV アッセイの ORF1a/b 遺伝子 Ct 値の割合は低いことが示されました。 Ct 値 (< 20 Ct) は 50.3% で、高い Ct 値 (36 ～ 40 Ct) は3.2%。図に示すように。1、Ct (< 20 Ct) анализа アボット SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, а Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а平均 Ct (36–40 Ct) 3,2%。 1、アボットSARS-CoV-2（遺伝子RdRpとNの組み合わせ）の最低Ct値（<20Ct）分析の割合は87.6%であり、サンシュア・バイオテック2019-nCoVのORF1a/b遺伝子分析のCt値は示した低 Ct 値 (< 20 Ct) の割合が 50.3% を占め、高値 Ct (36 ～ 40 Ct) の割合が占めていました。 Ct)は3.2%を占めた。図1に示すように、Abbott SARS-CoV-2検査（RdRpとN遺伝子の結合）の最小Ct値百分率（< 20 Ct）は87.6%で、Sansure Biotech 2019-nCoV検査のORF1a/b遺伝子Ct値は低いCtを示したCt 値 (< 20 Ct) の割合は 50.3%、高 Ct 値 (36 ～ 40 Ct) の割合は 3.2% でした。 図1に示すように、アボットSARS-CoV-2検査（RdRpとN遺伝子の組み合わせ）の最低Ct値パーセンテージ（<20Ct）は87.6%であり、Sansure Biotech 2019-nCoV検査のORF1a/b遺伝子Ct値低いCt値(< 20 Ct)の割合が50.3%、高いCt値を示します。 (36-40 Ct) の割合は 3.2% です。 Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное значение Ct (< 20 Ct) 87,6%、Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. 図 1 に示すように、アボット SARS-CoV-2 アッセイ (RdRp 遺伝子と N 遺伝子を組み合わせたもの) の Ct 値の割合 (< 20 Ct) は 87.6% と最も低かったのに対し、Sansure の ORF1a/b 遺伝子の Ct 値はBiotech 2019 研究 – nCoV の分析では Ct が低いことが示されました。 平均価格は 20 セント (< 20 セント) で 50,3%、平均で 36–40 セント (36–40 セント) は 3,2% です。 値（< 20 Ct）の割合は 50.3%、高 Ct 値（36 ～ 40 Ct）の割合は 3.2% でした。アボットのSARS-CoV-2 B検査では30を超えるCt値が記録された。 一方、BGI SARS-CoV-2 アッセイでは、ORF1a/b 遺伝子の Ct 値が高い (> 36 Ct) 割合は 4% でした (図 1)。 一方、BGI SARS-CoV-2 アッセイでは、ORF1a/b 遺伝子の Ct 値が高い (> 36 Ct) 割合は 4% でした (図 1)。 BGI SARS-CoV-2 の検査結果は ORF1a/b で、Ct (> 36 Ct)、平均 4% です。 (1)。 一方、BGI SARS-CoV-2 遺伝子の解析では、ORF1a/b は高い Ct 値 (> 36 Ct) を示し、その割合は 4% でした (図 1)。一方、BGI SARS-CoV-2 検査では、ORF1a/b 遺伝子の割合は 4% の高い Ct 値（> 36 Ct）でした（図 1）。 一方、BGI SARS-CoV-2 検出では、高い Ct 値 (>36 Ct) を持つ ORF1a/b 遺伝子の割合は 4% です (図 1)。 BGI SARS-CoV-2 の検査結果は、ORF1a/b で Ct (>36 Ct) 4% (1) でした。 一方、BGI SARS-CoV-2解析では、高いCt値（>36 Ct）を持つORF1a/b遺伝子の割合は4％でした（図1）。
この研究では、164 個の鼻咽頭サンプルを採取しました。すべてのタイプのアッセイについて、RNA の単離と増幅は、それぞれのメーカーが推奨する方法とキットを使用して実行されました。
この研究は、SARS-CoV-2 に対するアボットの検査が CRS と同じ検出性能を持ち、陽性、陰性、および全体的な一致が 100% であることを実証しました。コーエンのカッパ一致は 1.00 で、CRS との完全な一致を示します。米国のワシントン大学による同様の研究では、SARS-CoV-2に対するアボット検査の全体的な感度と特異度は、CDCの検査室決定検査（LDA）と比較して、それぞれ93％と100％であることが判明した。 11. アボットの SARS-CoV-2 検出システムは、N 遺伝子と RdRp 遺伝子の同時組み合わせ検出に基づいており、両方の遺伝子の感度が高く、偽陰性を最小限に抑えます12。オーストリアのウィーンでの研究でも、抽出サンプル量と検出溶離液量が多いと、希釈効果が最小限に抑えられ、検出効率が向上することが示されました 13。したがって、アボットの SARS-CoV-2 アッセイへの完全な適合は、組み合わせ遺伝子の検出、多数のサンプル (0.5 ml) の抽出、および大量の溶離液 (40 μl) の使用を同時に行うプラットフォーム検出システムと関連付けることができます。
また、大安遺伝子検査の検出性能はCRSとほぼ同等であることも結果からわかりました。これは、中国の淮南にある安徽大学で実施された研究 14 と、100% 肯定的な一致であるというメーカーの主張と一致しています。一貫した結果の報告にもかかわらず、1 つのサンプルは同じ溶出液の再検査後に偽陰性でしたが、アボット SARS-CoV-2 およびサンシュア バイオテック nCoV-2019 アッセイでは陽性でした。これは、異なる種類のアッセイ間では結果にばらつきがある可能性があることを示唆しています。 それにもかかわらず、中国で実施された研究 15 では、Daan Gene アッセイの結果は、研究室で定義された参照アッセイと比較して大幅に異なりました (p < 0.05)。 それにもかかわらず、中国で実施された研究 15 では、Daan Gene アッセイの結果は、研究室で定義された参照アッセイと比較して大幅に異なりました (p < 0.05)。 Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) от их лабораторного эталонного анализа。 しかし、中国での研究15では、Daan Gene の分析結果は、研究室の参照分析とは大きく異なりました (p < 0.05)。しかしながら、中国で行われた研究15では、大遺伝子検査の結果は、他の実験室で設定された基準検査と比べて大きな差があった(p < 0.05)。しかし、中国で行われた研究では 15、大安遺伝子検査の結果は、他の試験室で設定された基準検査と比較して <0.05 の差がありました。 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. しかし、中国での研究15では、Daan の遺伝子検査の結果は、参照する臨床検査と比較して有意に異なっていました (p < 0.05)。この不一致は、SARS-CoV-2 を検出するための参照検査の感度に起因する可能性があり、原因を特定するにはさらなる研究が重要である可能性があります。
さらに、私たちの研究では、SARS-CoV-2 BGI アッセイと CRS の比較パフォーマンスを評価し、優れた陽性パーセンテージ一致 (PPA = 97.9%)、陰性パーセンテージ一致 (NPA = 100%)、および性別ごとの全体的なパーセンテージ一致を示しました (オーパ）。 ）。 = 98.8%)。コーエンのカッパ値は良好な一致を示しました (K = 0.975)。オランダ 16 と中国 15 での研究では、一貫した結果が示されています。 SARS-CoV-2 BGI 検査は、10 µl の増幅/検出溶出液を使用する単一遺伝子 (ORF1a/b) 検出検査です。統計的には参照結果と良好に一致しているにもかかわらず、分析ではサンプル全体の 2 つの陽性サンプル (1.22%) が欠落していました。これは、患者レベルと地域社会レベルの両方で感染力学に臨床的に大きな影響を与える可能性があります。
この研究に含まれるもう 1 つの比較分析は、Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) アッセイでした。全体の一致率は 96.3% でした。一致の強さはコーエンのカッパ値によっても決定され、これは 0.925 であり、CRS との完全な一致を示しています。繰り返しますが、私たちの結果は、中国の長沙にある中南大学および中国柳州市の柳州人民病院の臨床検査部門で行われた研究と同一です17。 上記の良好な統計的一致が記録されたにもかかわらず、カイ二乗検定 (MacNemar 検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果には CRS と比較して統計的に有意な差があることが示されました (p < 0.005)。 上記の良好な統計的一致が記録されたにもかかわらず、カイ二乗検定 (MacNemar 検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果には CRS と比較して統計的に有意な差があることが示されました (p < 0.005)。 Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выгее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению с CRS (p < 0,005）。 上記の良好な統計的一致が記録されましたが、カイ二乗検定 (マクネマー検定) では、Sansure Biotech アッセイの結果が CRS と比較して統計的に有意な差があることを示しました (p < 0.005)。前述の良好な一致性が認められたにもかかわらず、サンシュア・バイオテックの検査結果はCRSと比較して臨床的な差があることが示された（p < 0.005）。上記の良好な一致性は認められましたが、しかし、検査（（マクネマー検査は、サンシュアバイオテクノロジーの検査結果が crs と比較して優れていることを示しました（（p <0.005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。））） Несмотря на отмеченное статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнемара) Sansure Biotech と CRS の結果 (p < 0,005)。 上記の良好な統計的一致にもかかわらず、カイ二乗検定 (マクネマー検定) では、Sansure Biotech アッセイと CRS の間に統計的に有意な差 (p < 0.005) が示されました。CRS と比較して 6 つのサンプル (3.66%) が偽陰性であることが判明しました (補足表 1)。これは、特にウイルスの感染力学を考慮すると非常に重要です。上記のデータも、この検出率の低さを裏付けています15。
この研究では、各アッセイおよびそれぞれのプラットフォームの Ct 値が決定され、アボット SARS-CoV-2 アッセイで報告された平均 Ct 値が最も低くなりました。この結果は、SARS-CoV-2 を検出するためのアボットの同時複合遺伝子検査システムに関連している可能性があります。したがって、図 1 によれば、アボット SARS-CoV-2 の結果の 87.6% で Ct 値が 20 未満でした。20 ～ 30 の範囲にあったサンプル結果は少数 (12.4%) のみでした。 30を超えるCt値は記録されませんでした。アボット社が SARS-CoV-2 パネル遺伝子検査形式を使用していることに加えて、この結果は検出下限値 (32.5 RNA コピー/mL)18 に関連している可能性があります。これは、同社の下限値である 100 RNA コピーの 3 分の 1 です。 /mL。 ml）19．
この研究にはいくつかの制限があります。第一に、リソースが不足しているため、[ウイルス量やその他の臨床検査 (LDA) などの] 標準/参照方法がありません。第二に、この研究で使用されたすべての検体は鼻咽頭ぬぐい液でしたが、結果は他の種類の検体には適用できませんでした。第三に、サンプルサイズが小さかったことです。
この研究では、鼻咽頭サンプルを使用した SARS-CoV-2 の 4 つの rRT-PCR アッセイのパフォーマンスを比較しました。 Sansure Biotech アッセイを除いて、すべての検出アッセイはほぼ同等のパフォーマンスを示しました。 さらに、Sansure Biotech アッセイでは CRS と比較して陽性率が低いことが確認されました (p < 0.05)。 さらに、Sansure Biotech アッセイでは CRS と比較して陽性率が低いことが確認されました (p < 0.05)。 Sansure Biotech が CRS を取得したことを確認しました (p < 0,05)。 さらに、Sansure Biotech 検査では、CRS と比較して陽性結果の割合が低いことが示されました (p < 0.05)。さらに、Sansure Biotech の検査では CRS と比較して低かった (p < 0.05)。さらに、Sansure Biotech の検査では CRS と比較して低かった (p < 0.05)。 サンシュア バイオテック社は、CRS の研究を行っています (p < 0,05)。 さらに、Sansure Biotech アッセイは CRS と比較して陽性率が低かった (p < 0.05)。PPA、NPA、および全体的な一致の Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) 分析では、一致値のコーエン カッパ強度が 0.925 で 93.5% を超えました。最後に、Sansure Biotech Assay (RUO) はエチオピアで使用するにはさらなる検証が必要であり、個々のメーカーの主張を評価するために追加の研究を考慮する必要があります。
比較研究デザインは、アディスアベバのエカ・コテベ病院、ミレニアム・チャーチ治療センター、ゼウディトゥ記念病院、セント・ピーターズ結核専門病院の4つの医療施設で実施された。データは2020年12月1日から31日までに収集されました。この研究の対象となった医療施設は、症例数の多さと市内の主要な治療センターの利用可能性に基づいて意図的に選択されました。同様に、ABI 7500 および Abbott m2000 リアルタイム PCR 装置を含む装置は NAAT 試薬メーカーの推奨に従って選択され、エチオピアのほとんどの研究室が少なくとも 4 つの PCR 検出キットを使用したため、この研究には 4 つの PCR 検出キットが選択されました。そのうちの4つ。研究中に実施された遺伝子検査、アボットSARS-CoV-2検査、サンシュア・バイオテック検査、およびSARS-CoV-2 BGI検査）。
SARS-CoV-2の検査は、EPHIと呼ばれる新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の調査を受けている個人から採取したウイルス輸送培地（VTM）（Miraclean Technology、深セン、中国）3 mlを使用して、2020年12月1日から30日まで実施された。鼻咽頭サンプルは訓練を受けたサンプル収集員によって収集され、三重パックで EPHI に送られました。核酸を単離する前に、各サンプルには固有の識別番号が割り当てられます。各サンプルは、到着後すぐに手動および自動抽出方法を使用して抽出されます。したがって、Abbott m2000 の自動抽出では、1.3 ml (デッドボリューム 0.8 ml および抽出入口ボリューム 0.5 ml を含む) のサンプルを各サンプルから抽出し、Abbott DNA サンプル調製システム (Abbott Molecular Inc. des Plaines、米国イリノイ州）。 ) 96 個のバッチ [92 個のサンプル、2 個の検出対照および 2 個の非鋳型対照 (NTC)] が、リアルタイムでの 2 ラウンドの SARS-CoV-2 (EUA) の全体的なプロセス (検索と検出) に含まれました。採掘。同様に、手動抽出の場合は、同じサンプルを使用します (自動抽出と検出用)。したがって、プロセス全体を通じて、140 μl のサンプルを等分し、QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH、ドイツ、ヒルデン) を使用して 9 ラウンドにわたって 24 バッチ (20 サンプル、2 つのアッセイコントロール、および 2 つの NTC を含む) で抽出しました。手動で抽出された溶出液は、SARS-CoV-2 BGI アッセイ、Daan Gene アッセイ、および Sansure Biotech アッセイを使用する ABI 7500 サーマル サイクラーを使用して増幅および検出されました。
SARS-CoV-2 ウイルス RNA の自動分離と精製は、アボット DNA サンプル調製試薬を使用した磁気ビーズの原理に従います。サンプルの不活化とウイルス粒子の可溶化は、タンパク質を変性させ、RNase を不活化するグアニジンイソチオシアネートを含む界面活性剤を使用して行われます。次に、シリカを使用した固相分離によって RNA がタンパク質から分離されます。つまり、グアニジニウム塩と溶解バッファーのアルカリ性 pH が核酸とシリカ (SiO2) の結合を促進します。すすぎのステップでは、残っているタンパク質や破片が除去され、透明な溶液が生成されます。透明な RNA は、装置の磁場を使用してシリカベースの微粒子から分離されます 20,21。一方、手動によるRNAの分離・精製は、磁気スタンドの代わりに遠心分離を行い、溶離液から微粒子を分離するスピンカラム法によって行われます。
アボットリアルタイム SARS-CoV-2 検出テスト (Abbott Molecular, Inc.) は、WHO および FDA から EUA19,22 を取得した製造業者の指示に従って実施されました。このプロトコルでは、抽出前のサンプルの不活化を 56 °C のウォーターバスで 30 分間実行しました。ウイルス不活化後、Abbott m2000 DNAサンプル調製システムを使用して、0.5 ml VTMからAbbott m2000 SP装置で核酸抽出を実行しました。メーカーによると。増幅と検出は Abbott m2000 RT-PCR 装置を使用して実行され、RdRp 遺伝子と N 遺伝子の二重検出が実行されました。 ROX) および VIC P (独自の色素) を使用して内部対照のターゲティングと検出を行い、両方の増幅産物の同時検出を可能にします 19 。
このキットの増幅検出方法はワンステップ RT-PCR 技術に基づいています。 ORF1a/b および N 遺伝子は、標的領域の増幅を検出するために Daan Gene Technology によって保存領域として選択されました。サンプル中の SARS-CoV-2 RNA を検出するために、特定のプライマーと蛍光プローブ (FAM で標識された N 遺伝子プローブ、VIC で標識された ORF1a/b プローブ) が設計されています。最終溶離液およびマスターミックスは、5 μl の溶離液を 20 μl のマスターミックスに加えて最終容量 25 μl にすることによって調製しました。増幅と検出は、ABI 750024 リアルタイム PCR 装置で同時に実行されました。
ORF1a/b および N 遺伝子は、Sansure Biotech nCoV-2019 核酸診断キット (蛍光 PCR 検出) を使用して検出されました。 ORF1a/b 領域の FAM チャネルと N 遺伝子の ROX チャネルを選択して、各ターゲット遺伝子に特異的なプローブを準備します。このアッセイキットには、溶離液およびマスターミックス試薬が次のように追加されます: 検出/増幅用に 30 μl のマスターミックス試薬と 20 μl の溶出サンプルを調製します。リアルタイム PCR ABI 750025 を増幅/検出に使用しました。
SARS-CoV-2 BGI 検査は、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) を診断するための蛍光リアルタイム rRT-PCR キットです。標的領域は、単一遺伝子検出法である SARS-CoV-2 ゲノムの ORF1a/b 領域にあります。さらに、ヒトのハウスキーピング遺伝子 β-アクチンは、内部で調節される標的遺伝子です。マスターミックス試薬 20 μl と抽出した RNA サンプル 10 μl をウェルプレート内で混合してマスターミックスを調製します26。 ABI 7500 蛍光定量リアルタイム PCR 装置を増幅と検出に使用しました。すべての核酸増幅、各アッセイの PCR 実行条件、および結果の解釈は、それぞれの製造元の指示に従って実行されました (表 3)。
この比較分析では、4 つの分析の一致率 (陽性、陰性、全体) およびその他の比較パラメーターを決定するために参照標準法を使用しませんでした。各検査の比較は CRS で行われました。この研究では、CRS は「任意の陽性」というルールによって設定され、結果は 1 つの検査ではなく、少なくとも 2 つの一致する検査結果を使用して決定されました。さらに、新型コロナウイルス感染症の場合、偽陰性の結果は偽陽性の結果よりも危険です。したがって、CRS 結果からできるだけ正確に「陽性」と判断するには、少なくとも 2 つのアッセイ検査が陽性である必要があります。これは、少なくとも 1 つの陽性結果が EUA アッセイから得られる可能性が高いことを意味します。したがって、4 つの検査結果のうち、同じ結果が得られた 2 つ以上の検査結果は、真陽性または陰性とみなされます 18,27。
データは構造化データ抽出フォームを使用して収集され、データ入力と分析は Excel 統計ソフトウェアと記述統計用の SPSS バージョン 23.0 を使用して実行されました。陽性、陰性、および全体的な一致率が分析され、カッパ スコアを使用して各手法と CRS の一致度が決定されました。カッパ値は次のように解釈されます: 軽度の一致の場合は 0.01 ～ 0.20、一般的な一致の場合は 0.21 ～ 0.40、中程度の一致の場合は 0.41 ～ 0.60、主要な一致の場合は 0.61 ～ 0.80、完全な一致の場合は 0.81 ～ 0.99。
アディスアベバ大学から倫理的許可を得ており、この研究のすべての実験プロトコルはエチオピア公衆衛生研究所の科学倫理審査委員会によって承認されました。 EPHI 倫理ライセンスの参照番号は EPHI/IRB-279-2020 です。すべての方法は、新型コロナウイルス感染症の治療のためのエチオピア国家包括的ガイドラインの推奨事項と規定に従って適用されました。さらに、研究に参加する前に、すべての研究参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
この研究で取得または分析されたすべてのデータは、この公開された論文に含まれています。この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて各著者から入手できます。
世界保健機関。 COVID-19 の臨床検査戦略に関する推奨事項: 暫定ガイダンス、2020 年 3 月 21 日 No. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO、2020)。
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Mouliou、DS & Gourgoulianis、KI 偽陽性および偽陰性の 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 症例: 呼吸器の予防と管理戦略、ワクチン接種、およびさらなる展望。 Mouliou、DS & Gourgoulianis、KI 偽陽性および偽陰性の 新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) 症例: 呼吸器の予防と管理戦略、ワクチン接種、およびさらなる展望。 Mouliou、DS & Gourgoulianis、KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная профилактика и стратегии лечения、вакцинация и дальнейзие перспективы. Mouliou、DS & Gourgoulianis、KI 新型コロナウイルス感染症の偽陽性と偽陰性の症例：呼吸器の予防と治療戦略、ワクチン接種と今後の進め方。ムリウ、DS およびグルグリアニス、KI 新型コロナウイルス感染症の偽陽性および偽陰性症例：呼吸器の予防と治療、ワクチン接種の戦略、および今後の方向性。専門家のレスピアー牧師。薬。 15(8)、993–1002 (2021)。
Mouliou, DS、Ioannis, P. & Konstantinos, G. 救急部門における新型コロナウイルス感染症の診断: 木を見ても森を失う。 Mouliou, DS、Ioannis, P. & Konstantinos, G. 救急部門における新型コロナウイルス感染症の診断: 木を見ても森を失う。Mouliou, DS、Ioannis, P.、Konstantinos, G. 救急部門における新型コロナウイルス感染症の診断: 木を見て森を失う。Muliou DS、Ioannis P.、および Konstantinos G. 緊急治療室における新型コロナウイルス感染症診断: 木を育てるには森が足りない。現れる。薬。 J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022)。
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